利用UHPLC-MS/MS评价SPE提取人体尿液中的阿片类药物

背景

任何固相萃取（SPE）或样品制备方法开发的目标都是获得最-佳的分析物回收率，同时最-大程度地减少到达最-终分析样品的污染化合物的浓度。传统的松散填充SPE产品易受各种技术问题的影响，如树脂装填不足所致。在方法开发过程中，不一致的填充可能会成为问题，从而导致排空和通道化，从而增加了获得不良分析物回收率的风险。

Microlute^TM CP SPE系列消除了制造过程中的松散包装，克服了样品制备过程中经常遇到的常见技术问题。取而代之的是，它由*的，固态的杂化聚合物结果组成，该结构由固定在固位介质上的均匀分布的孔的互连网络组成。这种设计可增强样品的流通性，以最-大程度地提高分析物与固相之间的相互作用，从而提供高度可重复的SPE方法。

本应用描述了使用强阳离子交换（SCX）SPE 30 mg 96孔微孔板的SPE LC/MS方法，用于测定人尿中的12种阿片类药物。它还检查了杂化聚合物产品相对于散装板的性能优势。

介绍

阿片类药物危机

阿片类药物被认为是缓解疼痛最-有效的药物，被归类为减轻患者痛苦的重要部分[1].。这类药物在止痛方面的功效，也被用于娱乐目的而引起很多争议。因阿片类药物使用的正常化，而导致*对它们广泛成瘾和滥用。据估计，欧洲在2017年[2]又130万高风险使用者，而美国2018 [3]年估计有1030万 12岁以上的人滥用阿片类药物。

 随着阿片类药物滥用的增加，在实验室检测阿片类药物的存在变得更为重要，用以帮助发现滥用阿片类药物的患者，同时仍使其他患者正常使用阿片类药物缓解疼痛。实验室测试对于帮助解决美国的阿片类药物危机起着关键作用。Quest诊断人员（美国国家大型临床实验室）分析了其2011年至2017年药物测试数据，其中包含了390万个身份不明的药物检测测试。该报告指出，从2011年至2017年，每年进行的大多数测试均被归类为与规定量的预期结果不一致。因此，可以从这些结果中得出结论，需要进行测试以确认患者是否正在滥用处方或将其他非法药物与处方一起使用。如果患者按照处方使用阿片类药物或无视他们的计划并导致滥用，则可以通过色谱尿液药物测试来进行最-终验证。

阿片类药物的检测

目前有两种检测尿样阿片类药物的方法：一种免疫分析筛选测试和一种色谱测试。标准的阿片类药物免疫测定通常设计用于检测天然吗-啡样分子（吗-啡和可待-因），但不能检测到诸如芬-太-尼和美-沙-酮之类的合成阿片类药物。使用色谱技术的优势在于可以通过一种方法识别所有不同的阿片类药物，以针对不同的类别。它还提供了样品中每个阿片类药物的定量结果，而不是定性免疫分析结果。

其他测定尿液中阿片类药物的技术包括色谱法“dilute and shoot”，该方法涉及用内标溶液稀释样品并直接注入LC-MS系统。但是，与固相萃取（SPE）方法相比，它不能浓缩样品。由于尿样中经常存在少量的阿片类药物，这可能会导致加阴性，尤其是在质谱仪上反应不强烈的阿片类药物。SPE还可以从尿液样品中去除“dilute and shoot”中存在的任何基质成分。这些会影响阿片类药物的电离并在MS离子源中积累，导致结果不可靠。还将导致更长的测试交付时间，昂贵的重新测试以及更长的仪器维护时间。

本应用简报展示了如何将SCX混合模式SPE方法与UHPLC-MS/MS相结合使用，以可靠，可重复的方式分析人尿液样品中的12中天然，半合成和合成阿片类药物和代谢物。

化合物

吗-啡，羟-吗-啡-酮，去-甲-羟-考-酮，氢-可-酮，去-甲-氢-可-酮，O-去-甲-基-顺-式-曲-马-多，降-芬-太-尼，顺-式-曲-马-多，哌-啶，芬-太-尼，E-D-D-P，美-沙-酮。 所有化合物均以1 mg / mL的形式从Cerilliant购买。

样品制备

在甲醇中制备了所有阿片类物质（3ug/ml）的储备液。为了制备尿液样品，将12.5ml混合来源的混合性别的空白人尿加入625ul阿片样物质储备溶液。通过向12.5ml尿液中加入625 µL甲醇来制备空白。样品和空白均用1％甲酸的水溶液以1：1稀释，并涡旋1分钟以使溶液均质。

对于混合模式SPE，Microlute™CP SCX 30 mg 96孔板的每个孔（目录号PSCX030P-001）用1,000 µL甲醇调理，然后用1,000 µL水平衡。将每个预处理的样品和空白样品*加到孔板中。上样后，用1,000 µL的0.1％甲酸水溶液洗涤每个孔，然后加入1,000 µL的0.1％甲酸甲醇溶液。 每个孔用2 x 400 µL 45:45:10脱甲醇/乙腈/ TEA洗脱。在室温下，使用带有直针的96针头（目录号229036）和 氮吹仪MiniVap Gemini（目录号500234）在N2下蒸发洗脱至干燥，大约需要45分钟。在100 µL起始流动相（水中0.1％甲酸）中重构样品。峰值后标准由100 µL在起始流动相（0.1％甲酸的水溶液）中稀释的阿片样物质标准溶液（1500 ng / mL）重建空白溶液孔。在市售的散装96孔板上也进行了相同的操作（图1）。

结果与讨论

色谱法

150 ng / mL校准标准品中所有化合物的色谱图如图2所示。色谱图的峰分配可以在表1中找到。

LC方法始于100％的水溶液，以确保在进样开始之前先洗脱洗脱溶液中仍可能存在的盐和最-具极性的组分，然后再从色谱柱上洗脱任何阿片类药物。这防止那些化合物干扰阿片样物质的电离。

第/一个要洗脱的阿片类药物峰是3.60分钟的吗啡，最后一个峰是7.71分钟的美-沙-酮。 除氢-可-酮及其代谢物去-氢-可-酮以外，所有峰均被分离（化合物4,5）。由于前体离子的不同，这意味着没有信号干扰。

表1中列出了分析的12种阿片类药物和代谢物。在整个化合物范围内，极性各不相同：对于去甲-羟-可-待-酮，亲水性最-强的LogP值为0.70；对于E-D-D-P，最疏水性的LogP值为5.20。 所有分析的化合物均为弱碱，pKas范围为8.2-10.1，这意味着SCX（强阳离子交换）树脂是最-适合捕获和生产干净样品并注入LC-MS系统的SPE树脂。

回收率和再现性

此应用使用100 µL的重组量，这导致加到孔板上的1 mL尿液浓度达到原来的10倍。这样可以提高所分析每种化合物的灵敏度。 SPE的过程通过将分析物与树脂结合，同时洗掉尿液基质中存在的干扰化合物，从而帮助创建了一种更清洁的溶液－高水位洗涤液以清除任何极性化合物，并用甲醇洗涤液洗脱疏水性酸性和中性干扰物。当从SPE产品中洗脱样品时，这两种清洗方法有助于创建非常干净的溶液，从而在洗脱步骤时将干扰降至最-低。

使用Microlute™CP SCX 96孔板进行样品制备后，测量加到人尿液中的12种化合物中每种化合物的回收率。图3显示了从尿样加标样品前样品制备物中回收的所有化合物的平均回收率，大小为12个重复样品中的所有化合物。除哌-啶和E-D-D-P外，所有阿片类药物的回收率均大于80％。

使用与Microlute™CP SCX板上相同的方法，将回收率与市售30 mg散装产品进行比较。两种产品的比较结果见图4。与杂化聚合物相比，松散填充产品的回收率表明每种分析物的回收率都有所下降。提出这种减少是由于杂化聚合物的结构，该结构在分析物和色谱介质之间提供了更有效的相互作用。结果，整个Microlute™CP SCX板的整体上减少了分析物和溶剂的通道效应。

导流是液体沿着阻力最-小的路径通过SPE床的过程。因此，当尿液加到孔板上，由于穿过SPE床的流动路径不均匀，它可能无法与所有存在的树脂*相互作用。这有效地降低了产品的负载能力，并可能破坏分析物，导致回收率低。第二个问题是洗脱时，与杂化聚合物的洗脱量相比，溶剂与结合的分析物的接触较少，这可能导致回收率降低，并且需要更大的洗脱量。

孔间可重复性是衡量96孔板不同孔之间每个回收结果彼此之间有多接近的一种度量。这是确保对所收集结果有信心的一项重要措施。如果记录的重现性很低，可能会对收集的结果产生怀疑。对于方法验证，重要的指标是查看建议的指导原则以及可接受的级别。色谱生物分析测定法通常在LOD或LOQ水平[12、13、14]时，其RSD指标<15％或<20％[12、13、14]。这是一项非常重要的测试方法，您需要像阿片类药物测试那样放心，这可能会对接受测试的患者造成重大后果。

图5显示了回收率结果的％RSD。数据显示％RSD值范围从吗-啡的1.39％到E-D-D-P的5.95％。这些数字表明，这12个重复的重现性很好地落入了通常用于方法验证的％RSD指南的典型建议限值内。

概括

Microlute™ CP SCX能够检测尿液中的各种阿片类药物，包括天然，半合成和合成化合物，使其成为滥用药物分析的明显选择。SPE的过程允许样品浓缩，从而可以对较低浓度的样品进行更/灵敏的分析。对于‘dilute and shoot’方法，这是不可能的，因为该方法的核心原理是稀释样品。Microlute™ CP SCX微孔板还可以在不同类别的阿片类药物范围内提供有利的回收率，重现性低于RSD值的10%。这样可以确保产品提供可靠和可重复的结果，这是在药物测试中需要对数据输出充满信心的重要指标。

References:

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